Συστήματα για την ανακάλυψη και χαρακτηρισμό φαρμάκων

Ο αναλυτής κυτταρικών λειτουργιών σε πραγματικό χρόνο με αισθητήρα σύνθετης αντίστασης ηλεκτρικού κυττάρου-υποστρώματος έχει μοναδικές δυνατότητες που το καθιστούν απαραίτητο εξοπλισμό για τη σύγχρονη βιοϊατρική έρευνα.

Παρέχει εξειδικευμένες πληροφορίες για τις κυτταρικές λειτουργίες σε πραγματικό χρόνο και για μεγάλο χρονικό διάστημα βδομάδων χωρίς τη διακοπή του πειράματος. Με αυτό τον τρόπο δημιουργείται οικονομία πόρων και χρόνου και συλλέγονται ποσοτικά δεδομένα για δυναμικές διεργασίες των κυττάρων, όπως ο πολλαπλασιασμός, η κυτταροτοξικότητα και η κυτταρική μετακίνηση με μεγάλη ακρίβεια και επαναληψιμότητα.

Η ταυτόχρονη εκτέλεση πολλαπλών πειραμάτων για μεγάλα διαστήματα θα αυτοματοποιήσει τις κυτταρικές μελέτες και θα συμβάλει στην αύξηση της παραγωγικότητας των εργαστηρίων του κέντρου.

Η δυνατότητα παρακολούθησης σε πραγματικό χρόνο με αντικειμενικές μετρήσεις θα ενισχύσει την ποιότητα των ερευνητικών αποτελεσμάτων και θα οδηγήσει σε δημοσιεύσεις υψηλού κύρους και θα προσελκύσει συνεργασίες με ακαδημαϊκά ιδρύματα και τη βιομηχανία.

Πραγματοποιήθηκε πλήρης εγκατάσταση και βαθμονόμηση του συστήματος από εξειδικευμένο προσωπικό της εταιρίας παραγωγής Agilent με την παρουσία και τη βοήθεια της ελληνικής αντιπροσωπίας (Πήγασος ΑΕ) και πιστοποιήθηκε η καλή λειτουργία του συστήματος. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ενημέρωση όλου του ερευνητικού προσωπικού του κέντρου για τις δυνατότητες και τις πειραματικές εφαρμογές του συστήματος και επίδειξη της χρήσης του. Ακολούθησε, η hands-on εκπαίδευση προσωπικού από όλα τα εργαστήρια του κέντρου στη χρήση του συστήματος και πραγματοποιήθηκαν και επιλεγμένα πειράματα.

Αν και ο χρόνος εγκατάστασης του συστήματος είναι μόλις δυο μήνες, έχει ήδη χρησιμοποιηθεί με επιτυχία από δυο ερευνητικές ομάδες, και έχει προγραμματιστεί η χρήση του από ακόμα δυο εργαστήρια.

Τα αποτελέσματα ήταν πολύ ικανοποιητικά και συνέβαλαν στην ολοκλήρωση μέρους της μελέτης που βρίσκεται σε διαδικασία συγγραφής για δημοσίευση καθώς και στην παραγωγή προκαταρτικών αποτελεσμάτων για υποβολή αιτήσεων χρηματοδότησης.

Η μονάδα κυτταρομετρίας ροής και κυτταροδιαχωρισμού μεταξύ άλλων παρέχει σε ερευνητές του κέντρου και σε εξωτερικούς συνεργάτες την δυνατότητα ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης βιο-δείκτών σε βιολογικά υγρά όπως αίμα, ορός ή υπερκείμενο κυτταροκαλιεργιών. Συγκεκριμένα διαθέτει αναλυτές κυτταρομετρίας ροής για την διεκπεραίωση πολυπλεκτικών δοκιμασιών ανοσοπροσδιορισμού, αιματολογικό και βιοχημικό αναλυτή.

Το σύστημα πολλαπλής ανοσολογικής ανάλυσης Luminex είναι μια εξειδικευμένη εναλλακτική πλατφόρμα για την διεκπεραίωση πολυπλεκτικών δοκιμασιών ανοσοπροσδιορισμού. Τα πλεονεκτήματα του σε σχέση με την χρήση κλασικού αναλυτή κυτταρομετρίας ροής είναι η αυξημένη ευαισθησία, μεγαλύτερη γκάμα αντιδραστηρίων, αυξημένη δυνατότητα πολυπλεκτικότητας (65 στόχοι) αλλά και η συμβατότητα με γονιδιακές δοκιμές πολλαπλής έκφρασης. Το σύστημα αυτό θα διευκολύνει και θα διευρύνει τα υφιστάμενα πρωτόκολλά της μονάδας και θα οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων.

Ο εξοπλισμός έχει εγκατασταθεί με επιτυχία και έχει γίνει ένα πρώτο πείραμα επίδειξης από την προμηθεύτρια εταιρία. Επιπρόσθετα έχει ήδη κανονιστεί μία σειρά από πειράματα για την ανάλυση κυτταροκινών με την χρήση 21-δύναμης πολυπλεκτικής διαδικασίας η οποία θα διεκπεραιωθεί άμεσα.

Η προμήθεια του αυτοματοποιημένου συστήματος χρωματογραφίας στήλης ήταν απαραίτητη γιατί μειώνει τόσο το χρόνο όσο και το κόστος παραγωγής βιοδραστικών ενώσεων έναντι διαφόρων ασθενειών (όπως οι ινοπολλαπλασιαστικές), αντικείμενο με το οποίο ασχολείται το εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας στο ΕΚΕΒΕ Φλέμιγκ. 
Ο παραπάνω εξοπλισμός συμβάλει στη μεγαλύτερη παραγωγικότητα του εργαστηρίου, δεδομένου ότι μπορούν να τρέχουν παράλληλα μέχρι και 4 καθαρισμοί μειγμάτων ενώσεων (σε αντίθεση με μόνο έναν καθαρισμό που πραγματοποιούνταν πριν χειροκίνητα), ενώ η τεχνολογία του εξοπλισμού επιτρέπει και το υψηλότερο ποσοστό καθαρότητας των τελικών προϊόντων από τα μείγματά τους (ενδεικτικά ποσοστά >99%). 

Τα παραπάνω σε συνδυασμό, συμβάλουν στην παράλληλη εξέταση μεγάλου αριθμού ενώσεων σε διάφορες φαρμακολογικές διαδικασίες αποτίμησης της δράσης τους, αυξάνοντας σημαντικά τις πιθανότητες ανάπτυξης προχωρημένων οδηγών ενώσεων – πιθανών φαρμάκων, που είναι ένας από τους στόχους του Κέντρου.   

Κατά τη διαδικασία εγκατάστασης και ελέγχου καλής λειτουργίας, δοκιμάστηκε η απομόνωση ενός ενδιαμέσου προϊόντος από μείγμα του, η οποία είχε αποτύχει με χειροκίνητη χρωματογραφία στήλης στο παρελθόν. Ο συγκεκριμένος καθαρισμός πέτυχε όταν δοκιμάστηκε με το συγκεκριμένο εξοπλισμό σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα (15 λεπτά). 

Από την εγκατάστασή του εξοπλισμού, έχουν επιχειρηθεί περίπου 50 καθαρισμοί μειγμάτων ενδιαμέσων και τελικών προϊόντων, με μεγάλη επιτυχία. Επιπλέον, τα διάφορα μεγέθη στηλών που χρησιμοποιεί ο συγκεκριμένος εξοπλισμός επιτρέπουν τον καθαρισμό διαφόρων ποσοτήτων μειγμάτων παράλληλα (από μερικά mgs μέχρι και 5 g), γεγονός που οδηγεί στην παράκαμψη επαναλαμβανόμενων καθαρισμών ορισμένων ποσοτήτων μειγμάτων ουσιών προς απομόνωση μεγάλης ποσότητας του επιθυμητού προϊόντος (όπως γινόταν χειροκίνητα).

Η προμήθεια του microplate reader BMG Labtech Fluostar ήταν απολύτως απαραίτητη για την ενίσχυση των ερευνητικών δυνατοτήτων του ΕΚΕΒΕ «Αλέξανδρος Φλέμιγκ». Ο εξοπλισμός αυτός προσφέρει προηγμένες δυνατότητες ανάλυσης φθορισμού, απορρόφησης, χημειοφωταύγειας και άλλων τεχνικών υψηλής ευαισθησίας, που είναι κρίσιμες για την εκτέλεση βιοϊατρικών πειραμάτων αιχμής. Η εγκατάσταση του οργάνου επιτρέπει πλέον την επιτάχυνση της έρευνας σε πεδία όπως η μελέτη πρωτεϊνών, η φαρμακευτική ανάπτυξη, η βιοτεχνολογία και οι νόσοι που σχετίζονται με την εσφαλμένη αναδίπλωση πρωτεϊνών. Σε μακροπρόθεσμο ορίζοντα, ο εξοπλισμός θα συμβάλει καθοριστικά στην ενίσχυση της διεθνούς ανταγωνιστικότητας του κέντρου και θα προάγει τη συμμετοχή του σε συνεργατικά ερευνητικά έργα μεγάλης εμβέλειας.

Η εγκατάσταση του microplate reader ολοκληρώθηκε επιτυχώς, με πλήρη έλεγχο καλής λειτουργίας από τους τεχνικούς της εταιρείας. Ο εξοπλισμός έχει ήδη τεθεί σε χρήση από ερευνητικές ομάδες του κέντρου. Κατά τους πρώτους μήνες λειτουργίας:
• Έχουν εκτελεστεί >10 πειραματικά πρωτόκολλα (π.χ. μετρήσεις κινητικής ενζύμων, φθορισμού σε κυτταρικές σειρές, screening μικρών μορίων).
• Έχουν παραχθεί αξιόπιστα δεδομένα υψηλής ποιότητας, τα οποία χρησιμοποιούνται σε δύο ερευνητικά έργα χρηματοδοτούμενα από την ΕΕ.
• Τουλάχιστον 3 ερευνητικές ομάδες αξιοποίησαν τον εξοπλισμό και τουλάχιστον 3 επιπλέον αναμένεται να τον αξιοποιήσουν τους επόμενους μήνες, βελτιώνοντας την αποτελεσματικότητα και την ταχύτητα των πειραμάτων τους.
• Η χρήση του οργάνου έχει οδηγήσει σε σημαντική εξοικονόμηση χρόνου και κόστους, καθώς αντικαθιστά παλαιότερες, πιο χρονοβόρες μεθόδους.

Οι θετικές επιπτώσεις είναι ήδη εμφανείς: το κέντρο αποκτά πρόσβαση σε τεχνολογίες αιχμής, γεγονός που ενισχύει την ερευνητική παραγωγικότητα, την ποιότητα των αποτελεσμάτων και την ελκυστικότητα για νέες συνεργασίες με ακαδημαϊκούς και βιομηχανικούς εταίρους.

Η προμήθεια συστήματος DLS κρίθηκε απαραίτητη για την ενίσχυση των δυνατοτήτων του εργαστηρίου στη βιοφυσική χαρακτηριστική πρωτεϊνών και βιομοριακών συστημάτων, η οποία αποτελεί κρίσιμο στάδιο στη διαδικασία ανακάλυψης και ανάπτυξης νέων φαρμάκων.

Η τεχνική DLS επιτρέπει τη γρήγορη και αξιόπιστη μέτρηση του υδροδυναμικού μεγέθους, της κατανομής μεγέθους και της κατάστασης συσσωμάτωσης πρωτεϊνών και άλλων βιομορίων σε διάλυμα. Οι πληροφορίες αυτές είναι ιδιαίτερα σημαντικές για την αξιολόγηση της σταθερότητας, της ποιότητας και της ομοιογένειας πρωτεϊνικών δειγμάτων, παραμέτρων που επηρεάζουν καθοριστικά τόσο τη βασική έρευνα όσο και τα στάδια ανάπτυξης υποψήφιων θεραπευτικών μορίων.

Στο πλαίσιο των ερευνητικών δραστηριοτήτων του Κέντρου, που επικεντρώνονται στη μελέτη μηχανισμών πρωτεϊνικής δυσλειτουργίας και στηn ανακάλυψη μικρομορίων που τροποποιούν τη συμπεριφορά πρωτεϊνικών στόχων, το σύστημα DLS αποτελεί βασικό εργαλείο για την αξιολόγηση της συμπεριφοράς πρωτεϊνών σε διαφορετικές συνθήκες, τον εντοπισμό και την αποφυγή συσσωμάτωσης, την παρακολούθηση αλλαγών στη δομή ή στα σύμπλοκα πρωτεϊνών μετά από αλληλεπίδραση με μικρομόρια. 

Η διαθεσιμότητα του εξοπλισμού ενισχύει σημαντικά την αξιοπιστία των πειραματικών δεδομένων και την ποιότητα των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται σε επόμενα στάδια βιοφυσικού χαρακτηρισμού και ανακάλυψης φαρμάκων. Παράλληλα, υποστηρίζει την ανάπτυξη ολοκληρωμένων πειραματικών pipelines που συνδυάζουν διαφορετικές τεχνικές βιοφυσικής ανάλυσης.

Σε μακροπρόθεσμο επίπεδο, η υποδομή αυτή συμβάλλει στην ενίσχυση της ερευνητικής ικανότητας του Κέντρου στον τομέα της βιοϊατρικής καινοτομίας και της ανακάλυψης νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, ενισχύοντας ταυτόχρονα τη δυνατότητα συμμετοχής σε διεθνείς συνεργασίες και ανταγωνιστικά ερευνητικά προγράμματα.
Η προμήθεια και εγκατάσταση του συστήματος DLS ολοκληρώθηκε επιτυχώς σύμφωνα με τις τεχνικές προδιαγραφές του έργου. Η εγκατάσταση πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο 310 του ΕΚΕΒΕ «Αλ. Φλέμκνγκ». Κατά τη διαδικασία εγκατάστασης πραγματοποιήθηκαν οι απαραίτητες ενέργειες εγκατάστασης, βαθμονόμησης και ελέγχου καλής λειτουργίας (performance verification) από τον προμηθευτή, ενώ παράλληλα πραγματοποιήθηκε εκπαίδευση των χρηστών του εργαστηρίου στη λειτουργία του οργάνου και στην ανάλυση των παραγόμενων δεδομένων.

Μετά την ολοκλήρωση των δοκιμών αποδοχής επιβεβαιώθηκε ότι το σύστημα λειτουργεί σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή και είναι πλήρως ενταγμένο στις ερευνητικές υποδομές του εργαστηρίου.

Μετά την εγκατάσταση, ο εξοπλισμός αξιοποιείται συστηματικά για τη χαρακτηριστική πρωτεϊνικών δειγμάτων και βιομοριακών συστημάτων που μελετώνται από τις ερευνητικές ομάδες του Κέντρου. Μέχρι σήμερα έχουν πραγματοποιηθεί τέσσερις (4) μετρήσεις μεγέθους και κατανομής πρωτεϊνικών δειγμάτων, οι οποίες υποστηρίζουν τη βελτιστοποίηση πειραματικών πρωτοκόλλων και την επιλογή κατάλληλων συνθηκών για επόμενα στάδια βιοφυσικής και βιοχημικής ανάλυσης.
Η χρήση του συστήματος είχε σημαντικές θετικές επιπτώσεις για τις ερευνητικές ομάδες, καθώς βελτίωσε σημαντικά την ποιότητα και την αξιοπιστία των πρωτεϊνικών δειγμάτων που χρησιμοποιούνται σε πειράματα, επέτρεψε τον γρήγορο εντοπισμό προβλημάτων συσσωμάτωσης ή αστάθειας, μειώνοντας τον χρόνο και το κόστος πειραματικών διαδικασιών, υποστήριξε την παραγωγή ποσοτικών δεδομένων υψηλής ποιότητας για επιστημονικές δημοσιεύσεις και ερευνητικές προτάσεις, ενίσχυσε τη συνεργασία μεταξύ ερευνητικών ομάδων που αξιοποιούν κοινές υποδομές βιοφυσικής ανάλυσης.

Επιπλέον, τα δεδομένα που παράγονται από το σύστημα DLS αξιοποιούνται ήδη σε εν εξελίξει ερευνητικά έργα, διδακτορικές διατριβές και συνεργασίες, συμβάλλοντας στην ενίσχυση της επιστημονικής παραγωγής και της ανταγωνιστικότητας του Κέντρου στον τομέα της βιοϊατρικής έρευνας.

Η προμήθεια συστήματος Isothermal Titration Calorimetry (ITC) κρίθηκε απαραίτητη για την ενίσχυση των ερευνητικών και τεχνολογικών υποδομών του Κέντρου στον τομέα της ανακάλυψης και ανάπτυξης νέων φαρμακευτικών μορίων. Ο συγκεκριμένος εξοπλισμός αποτελεί διεθνώς βασικό εργαλείο βιοφυσικής ανάλυσης για την ακριβή ποσοτική μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών και υποψήφιων φαρμακευτικών ενώσεων, οι οποίες αποτελούν κρίσιμο βήμα στη διαδικασία ανάπτυξης καινοτόμων θεραπειών.

Η εγκατάσταση του ITC επιτρέπει την ενίσχυση των δυνατοτήτων του εργαστηρίου στην επιβεβαίωση και βελτιστοποίηση υποψήφιων φαρμάκων, υποστηρίζοντας αποτελεσματικά τα επόμενα στάδια μετά τον αρχικό εντοπισμό βιοδραστικών μορίων. Με τον τρόπο αυτό διευκολύνεται η μετάβαση από τη βασική έρευνα σε πιο ώριμα στάδια προκλινικής ανάπτυξης, αυξάνοντας την πιθανότητα μεταφοράς της παραγόμενης γνώσης σε εφαρμογές με πραγματικό κοινωνικό και οικονομικό αντίκτυπο.
Παράλληλα, η συγκεκριμένη υποδομή ενισχύει σημαντικά την ανταγωνιστικότητα και την ελκυστικότητα του ερευνητικού οικοσυστήματος, καθώς παρέχει δυνατότητες προηγμένης βιοφυσικής ανάλυσης που υποστηρίζουν διεθνείς συνεργασίες, συμμετοχή σε ευρωπαϊκά ερευνητικά προγράμματα και συνεργασίες με τη βιομηχανία βιοτεχνολογίας και φαρμάκου.

Σε στρατηγικό επίπεδο, ο εξοπλισμός θα συμβάλει στην υλοποίηση των μακροπρόθεσμων στόχων του Κέντρου για την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων σε σοβαρές ασθένειες που σχετίζονται με δυσλειτουργίες πρωτεϊνών, ενισχύοντας παράλληλα τη θέση της Ελλάδας στον ευρωπαϊκό χάρτη της βιοϊατρικής έρευνας και της φαρμακευτικής καινοτομίας.

Η προμήθεια και εγκατάσταση του συστήματος ITC ολοκληρώθηκε επιτυχώς σύμφωνα με τις τεχνικές προδιαγραφές του έργου. Η εγκατάσταση πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο 310 του ΕΚΕΒΕ «Αλ. Φλέμιγκ». Κατά τη διαδικασία εγκατάστασης πραγματοποιήθηκαν όλες οι απαραίτητες ενέργειες παραλαβής, εγκατάστασης, βαθμονόμησης και ελέγχου καλής λειτουργίας (performance verification) από τον προμηθευτή, ενώ παράλληλα πραγματοποιήθηκε εκπαίδευση τριών (3) άμεσων χρηστών στη λειτουργία και τη βασική ανάλυση δεδομένων του οργάνου. Μετά την ολοκλήρωση των δοκιμών αποδοχής επιβεβαιώθηκε ότι το σύστημα λειτουργεί σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή και είναι πλήρως επιχειρησιακό.

Μετά την εγκατάσταση, ο εξοπλισμός ενσωματώθηκε άμεσα στις ερευνητικές δραστηριότητες του Κέντρου και χρησιμοποιείται για την ποσοτική μελέτη αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών και μικρομορίων. Μέχρι σήμερα έχουν πραγματοποιηθεί δώδεκα (12) πειράματα θερμοδυναμικής ανάλυσης, τα οποία αφορούν τη μελέτη αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών-στόχων που σχετίζονται με ασθένειες πρωτεϊνικής δυσλειτουργίας και υποψήφιων μικρομοριακών αναστολέων.

Η διαθεσιμότητα του εξοπλισμού είχε σημαντικές θετικές επιπτώσεις για τις ερευνητικές ομάδες του Κέντρου, καθώς επέτρεψε την ακριβή ποσοτική επιβεβαίωση της δέσμευσης υποψήφιων φαρμακευτικών μορίων σε πρωτεϊνικούς στόχους, επιτάχυνε τη διαδικασία χαρακτηρισμού και επιλογής υποσχόμενων ενώσεων για περαιτέρω ανάπτυξη, ενίσχυσε την ποιότητα των πειραματικών δεδομένων που χρησιμοποιούνται σε επιστημονικές δημοσιεύσεις και ερευνητικές προτάσεις, διευκόλυνε τη συνεργασία μεταξύ διαφορετικών ερευνητικών ομάδων που δραστηριοποιούνται σε συναφείς τομείς βιοϊατρικής έρευνας.

Επιπλέον, ο εξοπλισμός έχει ήδη συμβάλει στην υποστήριξη τριών (3) ερευνητικών έργων και συνεργασιών, καθώς και στην παραγωγή δεδομένων που αξιοποιούνται σε επιστημονικές δημοσιεύσεις, διδακτορικές διατριβές και ερευνητικές προτάσεις. Με τον τρόπο αυτό ενισχύεται ουσιαστικά η ερευνητική ικανότητα του Κέντρου στον τομέα της βιοφυσικής ανάλυσης και της ανακάλυψης νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.

Συνολικά, η εγκατάσταση και λειτουργία του συστήματος ITC έχει βελτιώσει σημαντικά την πειραματική υποδομή και την τεχνογνωσία των ερευνητικών ομάδων, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη ανταγωνιστικής έρευνας και στην προώθηση της βιοϊατρικής καινοτομίας.

Η προμήθεια συστήματος High Content Screening (HCS) με τεχνολογία spinning disk confocal ήταν απαραίτητη για την αυτοματοποιημένη, υψηλής απόδοσης ανίχνευση και ανάλυση φαρμακολογικά δραστικών ενώσεων σε επίπεδο κυττάρου—διαδικασία που δεν είναι εφικτή με συμβατικά συστήματα μικροσκοπίας. 

Το spinning disk confocal εξασφαλίζει ταχύτητα απεικόνισης ικανή για ζωντανά κύτταρα (live-cell imaging) με ελάχιστη φωτοτοξικότητα, ενώ η ρομποτική αυτοματοποίηση επιτρέπει σάρωση σε μεγάλη κλίμακα και με υψηλή στατιστική ανάλυση. 

Η πολυπαραμετρική ανάλυση εικόνας που ενσωματώνει το σύστημα επιτρέπει ταυτόχρονη αξιολόγηση πολλαπλών κυτταρικών φαινοτύπων, όπως κυτταρική μορφολογία, κυτταρικός κύκλος, αποπτωτικά γεγονότα και εντοπισμός πρωτεϊνών.

Μακροπρόθεσμα, η δυνατότητα αυτή θα εδραιώσει το κέντρο ως βασικό κόμβο για προκλινική ανακάλυψη και χαρακτηρισμό φαρμάκων, υποστηρίζοντας ερευνητικές συνεργασίες με φαρμακευτικές εταιρείες και ακαδημαϊκούς εταίρους σε ευρωπαϊκό επίπεδο.