Εξοπλισμός μικροσκοπίας και απεικόνισης

Το σύστημα υψηλής ανάλυσης απεικόνισης φθορισμού τύπου Single Molecule Localisation Microscopy (SMLM) και Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) μικροσκοπίας επιτρέπει την ανίχνευση μεμονωμένων μορίων σε υποκυτταρικό επίπεδο και παρέχει υπερσύγχρονες τεχνολογικές δυνατότητες για υψηλού επιπέδου επιστημονικές μελέτες. 

Συγκεκριμένα, η τεχνολογία SMLM  ήταν απαραίτητη για την υπέρβαση του ορίου ανάλυσης που θέτει η συμβατική μικροσκοπία, επιτρέποντας την απεικόνιση και εντοπισμό μεμονωμένων μορίων σε νανομετρική ακρίβεια (<20 nm). 

Η τεχνολογία TIRF περιορίζει τη διέγερση κοντά (~100–200 nm) στην πλασματική μεμβράνη του κυττάρου, επιτρέποντας την ανίχνευση μεμονωμένων μορίων με εξαιρετικά υψηλή αναλογία σήματος/θορύβου. 

Αυτές οι τεχνολογικές καινοτομίες παρέχουν τη δυνατότητα μοριακών και κυτταρικών αναλύσεων σε επίπεδο αδύνατο να επιτευχθεί με τον υπάρχοντα εξοπλισμό. Μακροπρόθεσμα, η προσθήκη αυτού του συστήματος θα ενισχύσει σημαντικά τις ερευνητικές δυνατότητες του κέντρου στη νανοκλίμακα απεικόνισης, θέτοντας τις βάσεις για ανταγωνιστικές ερευνητικές προτάσεις και συνεργασίες σε εθνικό και ευρωπαϊκό επίπεδο.

Η προμήθεια μικροσκοπίου απεικόνισης φθορισμού σε τρεις διαστάσεις και πραγματικό χρόνο ήταν απαραίτητη διότι η συμβατική απεικόνιση σε δύο διαστάσεις, αδυνατεί να αποτυπώσει την πλήρη χωρική οργάνωση και τη χρονική εξέλιξη βιολογικών διαδικασιών εντός ζωντανών κυττάρων ή τρισδιάστατων μοντέλων ιστών.

Το σύστημα αυτό επιτρέπει τη συνεχή παρακολούθηση δυναμικών διεργασιών—όπως κυτταρική μετακίνηση, αναδιοργάνωση κυτταροσκελετού, μιτωτικά γεγονότα και ενδοκυτταρική μεταφορά—στις πραγματικές τρεις χωρικές τους διαστάσεις και σε πραγματικό χρόνο, παρέχοντας δεδομένα με πολύ μεγαλύτερη βιολογική συνάφεια.

Επιπλέον, η δυνατότητα απεικόνισης Z-stack σε συνδυασμό με αλγορίθμους deconvolution βελτιώνει σημαντικά την ανάλυση και την ποιότητα της τρισδιάστατης απεικόνισης. Μακροπρόθεσμα, το σύστημα αυτό θα υποστηρίξει ανάπτυξη πρωτοκόλλων ζωντανής απεικόνισης (live imaging) σε organoids, σφαιροειδή (spheroids) και άλλα τρισδιάστατα μοντέλα, ενισχύοντας τη μεταφραστική διάσταση της έρευνας και τη δυνατότητα μελέτης κυτταρικών διεργασιών σε περιβάλλον εγγύτερο στις in vivo συνθήκες.

Η προμήθεια ορθού μικροσκοπίου με έγχρωμη κάμερα υψηλής ανάλυσης και θέσεις εργασίας ανάλυσης εικόνας ήταν απαραίτητη για την κάλυψη βασικών και καθημερινών αναγκών μορφολογικής, ιστολογικής και κυτταρολογικής αξιολόγησης δειγμάτων που απαιτούν υψηλής πιστότητας έγχρωμη αναπαραγωγή.

Σε αντίθεση με τα συστήματα φθορισμού, το ορθό μικροσκόπιο εφαρμόζεται άμεσα σε δείγματα που έχουν υποστεί τυπικές χρώσεις (π.χ. H&E), επιτρέποντας ταχεία και αξιόπιστη αξιολόγηση ιστολογικής μορφολογίας και παθολογικών αλλοιώσεων. 

Η ενσωμάτωση θέσεων εργασίας ανάλυσης εικόνας με εξειδικευμένο λογισμικό επιτρέπει ποσοτικοποίηση ιστολογικών παραμέτρων και αυτοματοποιημένη επεξεργασία εικόνων, βελτιώνοντας σημαντικά την αντικειμενικότητα και αναπαραγωγιμότητα των αναλύσεων. 
Μακροπρόθεσμα, το σύστημα αυτό θα αποτελέσει αναπόσπαστο εργαλείο τεκμηρίωσης για ευρύ φάσμα ερευνητικών πρωτοκόλλων, υποστηρίζοντας τη συστηματική αρχειοθέτηση εικονιστικών δεδομένων και την εκπαίδευση νέων ερευνητών.

Η προμήθεια του στερεοσκοπίου με δυνατότητα Stimulated Emission Depletion (STED) υπερ-ανάλυσης Olympus SZX2 RFA16, με αντικειμενικό φακό 1x, προσπίπτον φωτισμό και φθορισμό LED τριών φίλτρων (εύρος μεγεθύνσεων 7x–115x, με δυνατότητα έως 230x), ήταν απαραίτητη καθώς επιτρέπει υψηλής ποιότητας απεικόνιση και αξιόπιστη φθορίζουσα διαλογή ζωντανών και σταθεροποιημένων δειγμάτων (πχ εμβρύων, προνυμφών και ενηλίκων του μοντέλου οργανισμού Drosophila melanogaster καθώς και εμβρύων ποντικών) βασιζόμενη στην έκφραση δεικτών φθορισμού (fluorophore markers). 

Εξασφαλίζει την ταχεία, ήπια και υψηλής ευκρίνειας διαλογή των οργανισμών σε γενετικά πειράματα που βασίζονται σε φθορίζοντες δείκτες (π.χ. GFP, RFP) και για την αξιόπιστη επιλογή των σωστών γονοτύπων πριν από τις επόμενες χρονοβόρες αναλύσεις. 

Η χρήση LED φωτισμού, σε σύγκριση με συμβατικές πηγές (Hg), διασφαλίζει σταθερή ένταση, χαμηλή φωτοτοξικότητα και μειωμένη φωτολεύκανση, στοιχεία που περιορίζουν τα τεχνητά σφάλματα (artifacts) από τη διαδικασία απεικόνισης και επιτρέπουν μακρύτερες και συχνότερες παρατηρήσεις χωρίς επιβάρυνση της βιωσιμότητας των δειγμάτων. Έτσι, βελτιώνεται η επαναληψιμότητα και η αξιοπιστία των παραγόμενων ερευνητικών αποτελεσμάτων.

Κατά την εγκατάσταση και τον έλεγχο καλής λειτουργίας πραγματοποιήθηκαν δοκιμαστικές παρατηρήσεις φθοριζουσών Drosophila προνυμφών και ενηλικων και αξιολογήθηκε η ποιότητα του σήματος για τα τρία διαθέσιμα φασματικά κανάλια, η ομοιομορφία του φωτισμού και η ευκολία εναλλαγής μεταξύ φωτεινού πεδίου και φθορισμού, επιβεβαιώνοντας την πλήρη λειτουργία του οργάνου. Ήδη από την αρχική περίοδο χρήσης, το στερεοσκόπιο με φθορισμό υποστηρίζει σε καθημερινή βάση διαλογή προνυμφών και ενήλικων ατόμων Δροσόφιλας για επιλογή των επιθυμητών γονοτύπων. 

Μακροπρόθεσμα, η δυνατότητα αυτή θα αναβαθμίσει το κέντρο σε ανταγωνιστικό επίπεδο για ερευνητικά προγράμματα που απαιτούν νανο-κλίμακα χαρτογράφηση μοριακής οργάνωσης σε πραγματικό χρόνο και θα προσελκύσει νέες συνεργασίες με ερευνητικούς και βιομηχανικούς φορείς.

Η προμήθεια του στερεοσκοπίου Olympus SZX2 RFA16, με αντικειμενικό φακό 1x, προσπίπτον φωτισμό και φθορισμό LED τριών φίλτρων (εύρος μεγεθύνσεων 7x–115x, με δυνατότητα έως 230x), ήταν απαραίτητη καθώς επιτρέπει υψηλής ποιότητας απεικόνιση και αξιόπιστη φθορίζουσα διαλογή ζωντανών και σταθεροποιημένων δειγμάτων (πχ εμβρύων, προνυμφών και ενηλίκων του μοντέλου οργανισμού Drosophila melanogaster καθώς και εμβρύων ποντικών) βασιζόμενη στην έκφραση δεικτών φθορισμού (fluorophore markers). Εξασφαλίζει την ταχεία, ήπια και υψηλής ευκρίνειας διαλογή των οργανισμών σε γενετικά πειράματα που βασίζονται σε φθορίζοντες δείκτες (π.χ. GFP, RFP) και για την αξιόπιστη επιλογή των σωστών γονοτύπων πριν από τις επόμενες χρονοβόρες αναλύσεις. 

Η χρήση LED φωτισμού, σε σύγκριση με συμβατικές πηγές (Hg), διασφαλίζει σταθερή ένταση, χαμηλή φωτοτοξικότητα και μειωμένη φωτολεύκανση, στοιχεία που περιορίζουν τα τεχνητά σφάλματα (artifacts) από τη διαδικασία απεικόνισης και επιτρέπουν μακρύτερες και συχνότερες παρατηρήσεις χωρίς επιβάρυνση της βιωσιμότητας των δειγμάτων. Έτσι, βελτιώνεται η επαναληψιμότητα και η αξιοπιστία των παραγόμενων ερευνητικών αποτελεσμάτων.

Κατά την εγκατάσταση και τον έλεγχο καλής λειτουργίας πραγματοποιήθηκαν δοκιμαστικές παρατηρήσεις φθοριζουσών Drosophila προνυμφών και ενηλικων και αξιολογήθηκε η ποιότητα του σήματος για τα τρία διαθέσιμα φασματικά κανάλια, η ομοιομορφία του φωτισμού και η ευκολία εναλλαγής μεταξύ φωτεινού πεδίου και φθορισμού, επιβεβαιώνοντας την πλήρη λειτουργία του οργάνου. Ήδη από την αρχική περίοδο χρήσης, το στερεοσκόπιο με φθορισμό υποστηρίζει σε καθημερινή βάση διαλογή προνυμφών και ενήλικων ατόμων Δροσόφιλας για επιλογή των επιθυμητών γονοτύπων. 

Η προμήθεια συστήματος nanoindentation ήταν απαραίτητη για την εισαγωγή μετρήσεων μηχανοβιολογίας στο ερευνητικό πρόγραμμα του κέντρου—συγκεκριμένα, για την ποσοτική αξιολόγηση μηχανικών ιδιοτήτων κυττάρων και εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) σε νανοκλίμακα, όπως ελαστικό μέτρο Young, ιξωδοελαστικότητα και δυσκαμψία επιφανείας. 

Αυτές οι παράμετροι διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής συμπεριφοράς, της διαφοροποίησης κυττάρων και της προόδου παθολογικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένης της ίνωσης και της καρκινικής εξέλιξης. Μακροπρόθεσμα, η δυνατότητα αυτή θα αποτελέσει βάση για ανάπτυξη πρωτοποριακής ερευνητικής γραμμής στο ΕΚΕΒΕ Αλ. Φλεμιγκ, που εστιάζεται στο αναδυόμενο ερευνητικό πεδίο της μηχανοβιολογίας, ανοίγοντας νέες δυνατότητες για διαγνωστικές και θεραπευτικές προσεγγίσεις.

Η προμήθεια συστήματος πολυφωτονικής μικροσκοπίας φθορισμού (Two-Photon Excitation Microscopy, 2PEM) ήταν απαραίτητη για την απεικόνιση βιολογικών δειγμάτων μεγάλου πάχους (≥1 mm) που ξεπερνά τα όρια βάθους της συμβατικής συνεστιακής μικροσκοπίας (~100–200 μm). Η χρήση παλμικής ακτινοβολίας υπερύθρου (700–1000 nm) επιτρέπει βαθύτερη διείσδυση σε ιστούς και όργανα με ελάχιστη φωτοτοξικότητα και φωτολεύκανση (photobleaching), καθιστώντας το σύστημα ιδανικό για μακροχρόνια ζωντανή απεικόνιση παχέων δειγμάτων. 

Επιπλέον, η πολυφωτονική διέγερση παράγει ενδογενή σήματα από δομικές πρωτεΐνες (SHG από κολλαγόνο, CARS από λιπιδικές μεμβράνες) χωρίς εξωγενή σήμανση, επιτρέποντας την χαρτογράφηση ECM και της ιστικής αρχιτεκτονικής σε φυσιολογικές συνθήκες. Μακροπρόθεσμα, το σύστημα αυτό θα επιτρέψει in vivo και ex vivo απεικόνιση σε ζωικά μοντέλα, ανάπτυξη πρωτοκόλλων intravital microscopy και μελέτη δυναμικών διεργασιών σε ιστοτεμάχια οργάνων, αναβαθμίζοντας σημαντικά τη μεταφραστική ικανότητα του κέντρου.

Η προμήθεια των μικροσκοπίων EVOS M5000 και M7000 ήταν απαραίτητη για τον εκσυγχρονισμό των συστημάτων απεικόνισης κυτταροκαλλιεργειών του ΕΚΕΒΕ Φλέμιγκ και την κάλυψη της αυξανόμενης ζήτησης από τις ερευνητικές ομάδες μας που εργάζονται με κυτταρικές σειρές ή πρωτογενή κύτταρα, τα οποία είναι χημικά ή γενετικά σημασμένα με φθορίζουσες χρωστικές. 

Αυτά τα σύγχρονα μικροσκόπια παρέχουν σημαντικές τεχνολογικές εξελίξεις έναντι του παλαιότερου εξοπλισμού μας, συμπεριλαμβανομένης της αυτοματοποιημένης απεικόνισης πολλαπλών καναλιών φθορισμού, των βελτιωμένων αλγορίθμων αυτόματης εστίασης και των καμερών CMOS υψηλής ευαισθησίας που είναι ικανές να ανιχνεύουν χαμηλά σήματα φθορισμού με εξαιρετική ποιότητα εικόνας. 

Ο σχεδιασμός του EVOS M5000 με φθορισμό τεσσάρων χρωμάτων και χαρακτηριστικά αυτοματοποιημένης καταμέτρησης κυττάρων βελτιώνει σημαντικά τις δυνατότητες παρατήρησης των κυτταροκαλλιεργειών, ενώ το πλήρως αυτοματοποιημένο σύστημα του EVOS M7000 επιτρέπει εξελιγμένες εφαρμογές, όπως σάρωση πλακών πολλαπλών φρεατίων, απεικόνιση ζωντανών κυττάρων σε τακτά χρονικά διαστήματα και σάρωση περιοχών σε λειτουργίες Z-stack, δυνατότητες που είναι σημαντικές για τα ερευνητικά μας έργα.

Τα προηγμένα χαρακτηριστικά αυτοματισμού και οι δυνατότητες απεικόνισης σε πραγματικό χρόνο του EVOS M7000, σε συνδυασμό με την εύκολη χρήση και των δύο συστημάτων, αναμένεται να επιταχύνουν τον χρόνο εκτέλεσης και ανάλυσης των πειραμάτων, συμβάλλοντας σε δημοσιεύσεις υψηλού αντίκτυπου και ανταγωνιστικές αιτήσεις χρηματοδότησης για τις ερευνητικές ομάδες του ΕΚΕΒΕ Φλέμιγκ.

Από την εγκατάσταση των μικροσκοπίων ως σήμερα, και τα δύο όργανα έχουν επιδείξει εξαιρετική αξιοπιστία και ευκολία χρήσης και περίπου το 50% των ερευνητικών ομάδων μας θα χρησιμοποιήσει αυτά τα συστήματα καθημερινά, οδηγώντας σε ουσιαστικές βελτιώσεις στην ποιότητα των δεδομένων. 

Η μονάδα κυτταρομετρίας ροής και κυτταροδιαχωρισμού παρέχει σε ερευνητές του κέντρου και σε εξωτερικούς συνεργάτες εξειδικευμένο εξοπλισμό και υπηρεσίες για την διεκπεραίωση πρωτοκόλλων πολυπαραμετρικής φαινοτυπικής και λειτουργικής ανάλυσης κυττάρων αλλά και απομόνωσης τους. Η μονάδα είναι εξοπλισμένη με αναλυτές κυτταρομετρίας και κυτταροδιαχωριστές. 

Το μικροσκόπιο φωτός αποτελεί συνοδευτικό εξοπλισμό απαραίτητο για διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου τόσο της σωστής λειτουργίας του εξοπλισμού (αξιολόγηση καθαρότητας εξαρτήματος-nozzle του κυτταροδιαχωριστή) όσο και της ποιότητας του δείγματος πριν και μετά τον κυτταροδιαχωρισμό. 

Αντίστοιχα, η κυτταροκαλλιέργεια είναι απαραίτητο μέρος της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθείται από τα εργαστήρια του ΕΚΕΒΕ, που χρησιμοποιούν κυτταρικούς πληθυσμούς, είτε κυτταρικές σειρές, είτε πρωτογενή κύτταρα ως μοντέλο για τις ερευνητικές τους υποθέσεις. 

Το μικροσκόπιο φωτός αποτελεί εξοπλισμό απαραίτητο για διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου της σωστής μορφολογίας των κυτταρικών πληθυσμών που θα μπουν σε πειραματική διαδικασία, όσο και ποσοτικού ελέγχου. 

Η αναβάθμιση του υφιστάμενου συστήματος υπερήχων με τις προηγμένες εφαρμογές LV Trace, Auto LV, Color Doppler και Vevo Strain 2.0 κρίθηκε απαραίτητη για την ανάπτυξη επιπλέον δυνατοτήτων απεικόνισης υψηλής ποσοτικής λειτουργικής ανάλυσης σε προκλινικά πρότυπα καρδιαγγειακών νοσημάτων. 

Ο εξοπλισμός αυτός επιτρέπει την αυτοματοποιημένη μέτρηση παραμέτρων λειτουργίας της αριστερής κοιλίας (LV Trace, Auto LV), την ακριβή απεικόνιση αιμοδυναμικών μεταβολών μέσω του Color Doppler, καθώς και την λεπτομερή αξιολόγηση καρδιακής μηχανικής (strain analysis), ενισχύοντας σημαντικά την ακρίβεια και την αξιοπιστία των πειραματικών δεδομένων. 

Επιπλέον, η προσθήκη του συστήματος απεικόνισης με ενίσχυση σήματος (Contrst Imaging) και των εφαρμογών για ανάλυση και ποσοτικοποίηση μοριακών στόχων (VEVO-CQ), παρέχει τη δυνατότητα υψηλής ανάλυσης της αγγειακής λειτουργίας και επιτρέπει την χρονοειδική παρακολούθηση της λειτουργίας ιστών και οργάνων με τη χρήση ειδικών μοριακών στόχων. 

Οι ερευνητικές ομάδες του κέντρου έχουν την δυνατότητα της μη επεμβατικής παρακολούθησης της φυσιολογίας και παθολογίας οργάνων στο ίδιο πειραματόζωο σε διαφορετικά χρονικά σημεία, συμβάλλοντας στη μείωση του αριθμού των πειραματοζώων και στην εξαγωγή αξιόπιστων αποτελεσμάτων με στατιστική ισχύ. Με αυτό το τρόπο προάγεται η υψηλού επιπέδου έρευνα και καινοτομία του Κέντρου.

Μακροπρόθεσμα, η αναβάθμιση αυτή συμβάλλει στη στρατηγική ανάπτυξη του κέντρου μέσω παροχής νέων ανταγωνιστικών ερευνητικών πρωτοκόλλων, αύξησης δημοσιεύσεων υψηλού κύρους και προσέλκυσης εθνικών και διεθνών χρηματοδοτήσεων στον τομέα της καρδιαγγειακής βασικής και μεταφραστικής έρευνας. Επιπλέον, θα ενισχύσει τη θέση του Κέντρου σε υποδομές αιχμής για  in vivo προκλινική απεικόνιση διευρύνοντας τις επιστημονικές συνεργασίες με ακαδημαϊκούς και βιομηχανικούς φορείς. 

Σε συνέχεια της εγκατάστασης/αναβάθμισης, πραγματοποιήθηκαν δοκιμαστικές λήψεις και αναλύσεις στο πλαίσιο της εκπαίδευσης (training) από πιστοποιημένο ειδικό, με επιβεβαίωση της ορθής λειτουργίας των αυτοματοποιημένων εργαλείων ποσοτικής ανάλυσης. 

Στο πλαίσιο αυτό εκπαιδεύτηκαν στελέχη του ΕΚΕΒΕ, τα οποία ολοκλήρωσαν την πρακτική εξάσκηση σε πλήρη πρωτόκολλα καρδιακής απεικόνισης και strain analysis. Τα αποτελέσματα της εκπαίδευσης υποδηλώνουν σημαντική μείωση του χρόνου ανάλυσης μέσω των αυτοματοποιημένων εργαλείων και σημαντική βελτίωση της επαναληψημότητας μεταξύ χρηστών κατά τις δοκιμαστικές μετρήσεις.