Εξοπλισμός πρωτεωμικής και γονιδιωματικής ανάλυσης

Η αναβάθμιση της Μονάδας Πρωτεωμικής του ΕΚΕΒΕ Αλ. Φλεμιγκ με το νέο φασματογράφο μάζας (TimsTOF Ultra2, Bruker) έγινε σε μια χρονική περίοδο όπου η πρωτεωμική έχει πλέον τη δυνατότητα να πραγματοποιήσει αναλύσεις σε απειροελάχιστο υλικό με απίστευτη ευαισθησία.

Αυτή η βελτιωμένη ευαισθησία μας επιτρέπει να μειώσουμε το αρχικό δείγμα σε επίπεδα σχεδόν 1000 φορές πιο χαμηλά από ότι αναλύαμε με το προηγούμενό μας σύστημα του 2019. Ξεκινάμε πλέον με pico γραμμαρια αντί για micro γραμμάρια.

Έτσι η ερευνητική κοινότητα μπορεί να πραγματοποιήσει ανάλυση μοναδιαίου κυττάρου σε επίπεδο πρωτεώματος, πολύ σημαντικό μιας και οι πρωτεΐνες είναι τα μόρια που είναι οι πραγματικά εκτελούν τις διάφορες βιολογικές λειτουργίες. Το σύστημα όχι μόνο είναι υπερ-ευαίσθητο, είναι και γρήγορο, γεγονός που μας επιτρέπει ανάλυση σε αυξημένο βάθος. Μέχρι και σήμερα έχουν αναλυθεί περισσότερα από 2000 δείγματα και στα πλαίσια δοκιμών αλλά και σε πραγματικά πειράματα όπου τα αποτελέσματα είναι τόσο ποιοτικά που σίγουρα θα οδηγήσουν σε πολύ καλές δημοσιεύσεις.

Αρχικά, η ανάλυση πρότυπων δειγμάτων 250 pico-gram χρησιμοποιήθηκαν για να πιστοποιήσουν την καλή λειτουργία όλου του συστήματος. Παράλληλα, έχουμε αναλύσει το ίδιο δείγμα στα συστήματα που διαθέτουμε και συγκρίνουμε την ποιότητα των αποτελεσμάτων ως προς την ευαισθησία και το βάθος τους.

Φυσικά, το σύστημα δεν θα ήταν λειτουργικό χωρίς την υγρή χρωματογραφία νάνοροων και τα ιδιαίτερα λογισμικά (Proteoscape). Πρέπει επίσης να τονιστεί ότι η επιλογή και η εξέλιξη των μεθοδολογιών που χρησιμοποιούνται είναι μια δυναμική διαδικασία που προσαρμόζονται με τη διεθνή βιβλιογραφία και φυσικά σε κάθε ερώτημα. Σήμερα, είμαστε το μοναδικό ινστιτούτο της ευρύτερης περιοχής των Βαλκανίων που διαθέτει αυτού του είδους την τεχνολογία καθώς και την κατάλληλη τεχνογνωσία.

Το δεύτερο σύστημα LC-MS/MS (Σύστημα “T-Rex”- ImpactII, Bruker) που αγοράστηκε στο πλαίσιο του έργου 5173820 (χρηματοδότηση ΤΑΑ) προορίζεται για μια πλειάδα διαφορετικών εφαρμογών: Με αυτό το σύστημα μπορούμε να πραγματοποιήσουμε πειράματα μεταβολομικής και λιπιδομικής, ανάλυση μικρών μορίων αλλά και να στηθούν μελέτες δομικής πρωτεωμικής. Το σύστημα είναι σε στάδιο καθιέρωσης πειραματικών διαδικασιών σε συνδυασμό με τις ανάγκες του Κέντρου. Πρόσφατα ολοκληρώθηκε και η εκπαίδευση δύο ατόμων στη Γερμανία. 

Η προμήθεια του συστήματος Προετοιμασίας Ανάλυσης Μοναδιαίων Κυττάρων (CellENone X1 Neo, Cellenion) ήταν απαραίτητη για το διαχωρισμό και τη μελέτη ετερογενών πληθυσμών κυττάρων. Τέτοιοι πληθυσμοί αποτελούν την πλειονότητα των δειγμάτων που αναλύονται στη Μονάδα Πρωτεωμικής του ΕΚΕΒΕ Φλέμιγκ. Το εργαστήριο Πρωτεωμικής αναλύει δείγματα από διάφορες πηγές (πρωτογενή κύτταρα, κυτταρικές σειρές, ζωικά μοντέλα, βιοψίες και βιολογικά δείγματα ασθενών, κτλ) εξετάζοντας το σύνολο των πρωτεΐνών τους. Οι αναλύσεις αυτές, ενώ είναι πολύ ενημερωτικές, χάνουν σημαντικές πληροφορίες από σπάνια και ολιγάριθμα κύτταρα που βρίσκονται μέσα σε αυτά τα δείγματα – και που σε πολλές περιπτώσεις είναι καθοριστικής σημασίας για τη μελέτη, όπως πχ για την ταυτοποίηση συγκεκριμένων κυτταρικών στόχων σε φαρμακευτικές μελέτες.

Κατά τη διαδικασία εγκατάστασης και ελέγχου καλής λειτουργίας του συστήματος, έγιναν δοκιμαστικές αναλύσεις σε δείγματα κυττάρων διαμολυσμένων με πλασμίδια για την έκφραση διαφορετικών φθορίζουσων πρωτεΐνών. Οι αναλύσεις αυτές έγιναν στα πλαίσια εξοικείωσης με τις βασικές ρυθμίσεις του μηχανήματος. Μετά από αυτές τις αρχικές αναλύσεις το εργαστήριο Πρωτεωμικής βρίσκεται σε διαδικασίες βελτιστοποίησης των ρυθμίσεων του συστήματος. Η ομάδα στο Φλέμιγκ βρίσκεται σε μια διαρκή επικοινωνία με την μητρική εταιρεία για την επίλυση αποριών και βοήθεια στο σχεδιασμό των πειραμάτων. Αυτό επί του παρόντος γίνεται σε συνδυασμό με τις αντίστοιχες διαδικασίες για το σύστημα φασματογράφου μάζας LC-MS/MS, έτσι ώστε όταν στηθούν τα πρωτόκολλα ανάλυσης μοναδιαίων κυττάρων, να μπορεί να γίνεται με υψηλή ευαισθησία και η ανάλυση των αντίστοιχων πρωτεωμάτων. Τα συνδυασμένα πρωτόκολλα για την απομόνωση και την πρωτεωμική ανάλυση μοναδιαίων κυττάρων ήδη εξετάζονται σε πιλοτικά πειράματα κυτταρικών σειρών διαμολυσμένων με πρωτεΐνες ενδιαφέροντος εργαστηρίων του ΕΚΕΒΕ Φλέμιγκ, καθώς και σε κύτταρα ζωικών μοντέλων που μέχρι πρόσφατα έχουν αναλυθεί μόνο χωρίς διαχωρισμό.

Ο αυτόματος σταθμός εργασίας για την κατασκευή βιβλιοθηκών αλληλούχησης νέας γενιάς (next-generation sequencing, NGS), η απόκτηση του οποίου χρηματοδοτήθηκε από κονδύλια του Εθνικού Σχεδίου Ανάκαμψης και Ανθεκτικότητας, αποσκοπεί στην αυτοματοποίηση υπαρχόντων και νέων πρωτοκόλλων για την κατασκευή βιβλιοθηκών αλληλούχησης νέας γενιάς, για τη μετατροπή δηλαδή γενετικού υλικού (DNA, RNA) προερχόμενου από βιολογικά δείγματα σε μορφή η οποία μπορεί να υποστεί αλληλούχηση νέας γενιάς με σκοπό την μαζική ταυτοποίηση αλληλουχιών, ποσοτήτων νουκλεϊκών οξέων, κυττάρων, και άλλων χαρακτηριστικών των βιολογικών δειγμάτων, ανάλογα με την εφαρμογή. Η απόκτηση του σταθμού για τη Μονάδα Γονιδωματικής του Ε.ΚΕ.Β.Ε. «Αλέξανδρος Φλέμιγκ» κρίθηκε απαραίτητη για δύο κύριους λόγους: 

1. Την αύξηση του αριθμού των βιολογικών δειγμάτων τα οποία η Μονάδα μπορεί να επεξεργαστεί ανά χρονική περίοδο, την αύξηση δηλαδή της παραγωγικότητας της Μονάδας
2. Την τυποποίηση των διαδικασιών κατασκευής βιβλιοθηκών, με συνέπεια την αύξηση της ακρίβειας, ποιότητας, και αναπαραγωγιμότητας των πειραματικών χειρισμών της Μονάδας. 

Ο αυτόματος σταθμός εργασίας (Tecan Fluent 780 Liquid Handler) έχει εγκατασταθεί στη Μονάδα Γονιδιωματικής, και τουλάχιστον δύο διαφορετικά πρωτόκολλα κατασκευής βιβλιοθηκών έχουν ήδη αναπτυχθεί, ελεγχθεί και καθιερωθεί στο λογισμικό του μηχανήματος (πρωτόκολλα 3’ mRNA-sequencing και shotgun metagenomics/whole genome sequencing).

Έχουν ολοκληρωθεί τουλάχιστον δύο μεγάλα πειράματα κατασκευής βιβλιοθηκών, ένα για 3’ mRNA-sequencing (το οποίο περιλάμβανε μερικές δεκάδες δειγμάτων και σκοπό έχει την ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης σε βιολογικά δείγματα προερχόμενα από ιστούς ποντικού, για το εργαστήριο Βασίλη Αϊδίνη) και ένα για shotgun metagenomics (το οποίο περιλάμβανε ~800 βιολογικά δείγματα προερχόμενα από ανθρώπινα κόπρανα και σκοπό είχε την ταυτοποίηση του μικροβιώματος τους, για το εργαστήριο Αντιγόνης Δήμα). Να τονιστεί ότι ειδικά το δεύτερο πείραμα δε θα ήταν δυνατό να πραγματοποιηθεί χωρίς το σταθμό, εξαιτίας του μεγάλου αριθμού δειγμάτων και της ανάγκης για όσο το δυνατόν μεγαλύτερη ομοιογένεια και αναπαραγωγιμότητα στις παραγόμενες βιβλιοθήκες ώστε να είναι εφικτή η σύγκριση μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και ενδιαφέροντος. 

Είναι σε φάση υλοποίησης ή/και σχεδιασμού η δημιουργία επιπλέον πρωτοκόλλων για κατασκευή βιβλιοθηκών NGS (whole-exome sequencing, gene panel sequencing, mRNA sequencing, κ.α.). Να τονιστεί επίσης ότι σχεδιάζεται ο σταθμός να χρησιμοποιηθεί και για άλλες πειραματικές διαδικασίες εκτός από NGS, όπου είναι απαραίτητη η ακριβής μετακίνηση, ανάμειξη, ομογενοποίηση, διαχωρισμός, καθαρισμός μεγάλου αριθμού δειγμάτων που περιέχουν χημικά η βιολογικά υγρά (π.χ. σε πειράματα φαρμακολογικού, βιοφυσικού, κυτταρογενετικού, κτλ. ενδιαφέροντος).